Disfunctia plachetara in imbatranire si patologia cardiovasculara

CUVANT INAINTE

Plachetele sangvine au rol biologic esential in procesele de hemostaza si tromboza, pe langa acesta regland o varietate de raspunsuri inflamatorii si fiind participanti importanti in ateroscleroza care reprezinta cauza majora a morbiditatii si mortalitatii in tarile dezvoltate. Astfel, este importanta intelegerea rolului plachetelor in procesele inflamatorii care au loc la nivel vascular, cat si a relatiilor stabilite cu alte celule in procesul aterosclerotic. Conditiile patologice care determina alterari vasculare si dereglari ale fluxului sangvin pot transforma acest proces benefic (hemostaza), intr-un mecanism defectuos (tromboza) care conduce la obstructie arteriala, frecvent intalnita in vasele aterosclerotice din inima si creier. Alterarile la nivel plachetar sunt asociate cu inaintarea in varsta, stari patologice precum diabetul, hipertensiunea si cu ateroscleroza, maladii cu incidenta crescuta in societatea moderna, elucidarea mecanismelor celulare si moleculare implicate fiind utila in elaborarea de noi strategii terapeutice antitrombotice in tratarea acestora. Lucrarea de fata prezinta pe parcursul a sase capitole elementele fundamentale privind cunostintele actuale despre plachetele sangvine, elemente de la care am plecat in abordarea cercetarilor proprii si rezultatele studiile experimentale realizate. Primele patru capitole prezenta o sinteza a literaturii in domeniu, cu reliefarea rezultatelor validate de comunitatea stiintifica la nivelul secolului XXI si cu sublinierea atat a aspectelor care focalizeaza intens atentia in momentul de fata si in care cunoasterea evolueaza rapid, cat si a celor inca neclare ce necesita abordari ulterioare. Asadar, sunt prezentate morfologia si biochimia plachetelor sangvine, functiile acestora, fenomenul specific al activarii plachetare, etapa importanta in desfasurarea hemostazei normale si a procesului trombotic si modificarile metabolismului plachetar in conditii patologice asociate disfunctiei endoteliale, precum diabetul de tip 2, hipertensiunea si hipercolesterolemia.

In contextul intelegerii patofiziologiei plachetare si a mecanismelor moleculare implicate in activarea plachetara, in studiile experimentale realizate si prezentate in cadrul capitolului al cincilea am incercat sa raspundem la o serie de intrebari care vizeaza cresterea concentratiei citosolice de calciu si carbonilarea proteinelor plachetare in inaintarea in varsta si diabetul de tip 2, activarea plachetara si cresterea nivelelor de microparticule plachetare si endoteliale circulante in insuficienta venoasa cronica si modificarile la nivel plachetar in hipertensiunea asociata hipercolesterolemiei. Capitolul sase prezinta concluziile generale ale lucrarii subliniind originalitatea rezultatelor proprii obtinute si importanta acestora in intelegerea mecanismelor moleculare specifice ce stau la baza interactiunilor complexe asociate activarii plachetare. Multumiri pline de recunostinta, Doamnei Doctor Doina Popov, Membru corespondent al Academiei Romane, coordonatoarea stiintifica a tezei mele de doctorat care a stat la baza acestei lucrari, Doamnei Academician Maya Simionescu, colectivelor de cercetatori din Institutul de Biologie si Patologie Celulara ``Nicolae Simionescu`` si tuturor celor care au contribuit in diferite moduri la formarea mea profesionala.

Dr. Nicoleta ALEXANDRU

PREFATA

Subiectul acestei lucrari concentrat asupra disfunctiei plachetare asociata modificarilor sistemului cardiovascular in imbatranire si stari patologice este actual, complex, dificil, dar si generos. Studii recente demonstreaza ca printre numerosii factori de risc care conduc la ateroscleroza, proces inflamator cronic ce constituie principala cauza a maladiilor ischemice (la nivelul inimii si cerebral) care afecteaza o mare parte a populatiei lumii moderne se numara diabetul, hipertensiunea si hipercolesterolemia. Aceste conditii patologice sunt caracterizate de anomalii metabolice asociate cu disfunctia endoteliala, hipercoagulabilitate si activare plachetara care contribuie la accelerarea aterosclerozei. In plus, inaintarea in varsta creste riscul pentru aparitia bolilor cardiovasculare trombotice ca urmare a modificarilor care au loc nu numai la nivelul vasculaturii ci si al hemostazei, al procesului de coagulare si al celui fibrinolitic. Insuficienta venoasa cronica si consecintele sale: venele varicoase si hipertensiunea venoasa caracterizate si prin activare plachetara reprezinta de asemenea, una dintre cele mai frecvente boli care afecteaza calitatea vietii umane avand un puternic impact socio-economic.

Rezultatele studiilor experimentale originale cuprinse in aceasta lucrare aduc elemente noi, relevante pentru subiectul abordat in intelegerea mecanismelor moleculare specifice ce stau la baza interactiunilor complexe asociate activarii plachetare. Datele prezentate au atat valoare teoretica prin contributiile aduse in elucidarea patofiziologiei plachetare si a mecanismelor implicate in activarea plachetara, cat si rol practic prin realizarea unui nou model experimental animal. Modelul va putea permite elaborarea unor studii complexe de farmacologie, mai eficiente in tratarea complicatiilor trombotice asociate patologiei cardiovasculare ce afecteaza societatea moderna, precum si dezvoltarea unor strategii terapeutice de preventie si ameliorare a disfunctiei si activarii plachetare.

Dr. Doina POPOV, Membru corespondent al Academiei Romane

CUPRINS

Cuvant inainte 5
Prefata 7
Introducere 11

1. MORFOLOGIA SI BIOCHIMIA PLACHETELOR 13
1.1. Membrana plasmatica plachetara 13
1.1.1. Fosfolipidele membranare 13
1.1.2. Glicoproteinele membranare 14
1.2. Componentele citoscheletul plachetar 21
1.2.1. Microtubulii si filamentele de actina 21
1.2.2. Proteine citoscheletale asociate membranei plasmatice 21
1.2.3. Proteine care regleaza contractia 21
1.2.4. Proteine care regleaza formarea filamentelor de actina 23
1.3. Organele plachetare 24
1.3.1. Peroxizomii 24
1.3.2. Mitocondriile 24
1.3.3. Lizosomii 24
1.3.4. Corpii densi (Granulele dense) 24
1.3.5. Granulele alfa 25
1.3.6. Ribozomii si ARN mesager 30
1.4. Sisteme membranare plachetare 30

2. FUNCTIILE PLACHETELOR 32
2.1. Rol in hemostaza si tromboza 32
2.1.1. Adeziunea plachetelor la locul leziunii 33
2.1.2. Activarea plachetara si eliberarea continutului granulelor 33
2.1.3. Agregarea plachetelor si formarea trombusului 34
2.1.4. Distrugerea cheagului format si repararea tisulara 34
2.2. Plachetele ca celule imune 35

3. ACTIVAREA PLACHETARA 38
3.1. Molecule de semnalizare intermediare 39
3.2. Activatorii plachetari si receptorii acestora 42
3.2.1. Colagenul 42
3.2.2. Trombina 43
3.2.3. Nucleotide: ADP si ATP 45
3.2.4. Tromboxanul A2 47
3.2.5. Serotonina 48
3.2.6. Epinefrina 48
3.2.7. Vasopresina 49
3.2.8. Factorul de activare plachetar (PAF) 49
3.2.9. Trombospondina 49
3.2.10. Activatori lizofosfolipidici: acidul lizofosfatidic si sfingozin-1-fosfatul 50

4. MODIFICARI ALE METABOLISMULUI PLACHETAR IN CONDITII PATOLOGICE 51
4.1. Plachetele si diabetul zaharat 51
4.1.1. Alterari metabolice 52
4.1.2. Stresul oxidativ 54
4.1.3. Disfunctia endoteliala 55
4.2. Plachetele in hipertensiune 57
4.3. Plachetele in hipercolesterolemie 59
4.4. Plachete in ateroscleroza 65
4.4.1. Rolul plachetelor in procesul inflamator 66
4.4.2. Implicarea plachetelor in aterogeneza 67
4.4.3. Implicarea plachetelor in formarea celulelor spumoase 72
4.4.4. Implicarea plachetelor in etapa finala a aterosclerozei 74
4.5. Plachetele si procesul de imbatranire 75
4.5.1. Plachetele in boli neurodegenerative asociate imbatranirii 76
4.5.2. Senescenta plachetelor 77
4.6. Plachetele in insuficienta venoasa cronica 78

5. STUDII EXPERIMENTALE ASUPRA PLACHETELOR UMANE SI DE LA MODELE ANIMALE 80
5.1. Introducere si obiective 80
5.2. Metodologie experimentala 83
5.3. Cresterea concentratiei citosolice de calciu - etapa esentiala in procesul de activare plachetara 93
5.3.1. Efectul inaintarii in varsta a pacientilor cu diabet de tip 2, asupra concentratiei citosolice plachetare de calciu 93
5.3.2. Efectul homocisteinei asupra mobilizarii calciului si a functiei plachetare in diabetul de tip 2 99
5.4. Carbonilarea proteinelor plachetare - consecinta a stresului oxidativ si a activarii cu trombina, proces stimulat de inaintarea in varsta si diabetul de tip 2 114
5.5. Insuficienta venoasa cronica - patologie asociata cu activarea plachetelor si cu nivele crescute de microparticule plachetare si endoteliale circulante 121
5.6. Modificari la nivel plachetar in hipertensiunea asociata hipercolesterolemiei; efectul irbesartanului 130

6. CONCLUZII GENERALE 137

BIBLIOGRAFIE 141

INTRODUCERE

Plachetele sunt celule sangvine mici (diametrul cuprins intre 1,5-3 ?m), de forma discoidala, anucleate al caror rol biologic esential este in hemostaza si tromboza. Evenimentele care au loc in aceste procese implica: activarea, adeziunea si agregarea plachetelor concomitent cu generarea trombinei, transformarea fibrinogenului in fibrina si consolidarea cheagului de sange la locul unde s-a produs o leziune a peretelui vascular, oprind sangerarea.

Plachetele, pe langa rolul esential pe care il au in procesele de hemostaza si tromboza regleaza o varietate de raspunsuri inflamatorii reprezentand o legatura importanta intre inflamatie, tromboza si aterogeneza. Hipercoagulabilitatea si activarea plachetara observate in stari patologice contribuie la accelerarea aterosclerozei.

Printre numerosii factorii de risc care conduc la ateroscleroza, proces inflamator ce constituie principala cauza a bolilor ischemice de inima si cerebrovasculare, care sunt cele mai frecvente cauze ale morbiditatii si mortalitatii se numara diabetul, hipertensiunea si hipercolesterolemia, caracterizate de anomalii metabolice asociate cu disfunctii endoteliale si plachetare. Inaintarea in varsta creste riscul pentru aparitia bolilor cardiovasculare trombotice ca urmare a modificarilor care au loc nu numai la nivelul vasculaturii ci si al hemostazei, procesului de coagulare si al celui fibrinolitic. Insuficienta venoasa cronica si consecintele sale: venele varicoase si hipertensiunea venoasa caracterizate si prin activare plachetara reprezinta de asemenea, una dintre cele mai frecvente boli care afecteaza calitatea vietii umane avand un puternic impact socio-economic.

In conditii fiziologice plachetele circulante se afla in stare neactivata, dar ca raspuns la agonisti, in cazul unor lezari vasculare, sau in conditii patologice se activeaza, proces care consta in desfasurarea urmatoarelor evenimente:

1) cresterea concentratiei de calciu ionic citosolic ([Ca2+]i ) ca urmare a eliberarii acestuia din depozitele interne si a mecanismelor de intrare a Ca2+ in celula;
2) modificari complexe la nivelul citoscheletului care conduc la schimbarea formei discoidale a plachetei intr-o forma care prezinta prelungiri citoplasmatice;
3) schimbarea conformatiei GPIIb/IIIa intr-o stare cu afinitate mare de legare;
4) generarea de metaboliti ai acidului arahidonic (ex. Tromboxan A2);
5) fosforilarea proteinelor plachetare implicate in caile de semnalizare;
6) eliberarea continutului granulelor ?, al granulelor dense si a lizosomilor;
7) expresia la suprafata a proteinelor membranelor lizosomale si a granulelor ?;
8) activarea glicoproteinei GPIIb/IIa (?IIb?3), care ulterior, determina agregare plachetara;
9) inducerea activitatii coagulante plachetare.

Plachetele functioneaza si ca ``depozit`` pentru o varietate de molecule care le afecteaza functia, dar care pot influenta si alte procese precum inflamatia, vindecarea ranilor, tonusul vascular, fibrinoliza. Aceste molecule sunt fie eliberate de plachete, fie nou sintetizate odata cu activarea plachetara. Prin interactiunile biochimice complexe, plachetele pot comunica cu si pot fi afectate de alte celule sangvine, precum si de celulele endoteliale.

Patologia plachetara cuprinde diatezele hemoragice caracterizate prin dereglari cantitative si calitative ale plachetelor, iar in conditii patologice formarea necontrolata a trombusului plachetar poate conduce la obstructie vasculara si necroza ischemica, procese care au loc in infarctul de miocard si atacul cerebral.

Obiectivele acestei lucrari au vizat intelegerea patofiziologiei plachetare si a mecanismelor moleculare implicate in activarea plachetara. Am incercat sa raspundem la urmatoarele intrebari:

Influenteaza inaintarea in varsta nivelul concentratiei citosolice plachetare de ioni liberi de Ca2+, [Ca2+]i in conditii normale si de diabet de tip 2, precum si raspunsul la stimularea cu trombina?
Exista o corelatie intre [Ca2+]i plachetara si componentele circulante ale mediului diabetic precum: concentratia ridicata de glucoza, produsii - AGE si stresul oxidativ?
Care sunt mecanismele intracelulare prin care homocisteina afecteaza mobilizarea ionilor de calciu din depozitele intracelulare si functia plachetara in diabetul de tip 2?
Este carbonilarea proteinelor plachetare o consecinta a stresului oxidativ si a activarii induse de trombina?
Stimuleaza inaintarea fiziologica in varsta si diabetul de tip 2 formarea proteinelor carbonilate plachetare?
Afecteaza plachetele tonusul vascular al venulelor periferice umane la pacientii cu insuficienta venoasa cronica?
Exista o corelatie intre nivelele circulante crescute de microparticule de origine plachetara si endoteliala si modificarile structurale si functionale ale peretelui venos in insuficienta venoasa cronica?
Care sunt modificarile plachetare induse de actiunea concomitenta a hipertensiunii si hipercolesterolemiei? Este hamsterul hipertensiv-hipercolesterolemic un model experimental eficient, care mimeaza metabolic si patofiziologic afectiunile umane si dezvolta leziuni aterosclerotice?
Cum influenteaza irbesartanul efectele induse de hipertensiune si hipercolesterolemie? Poate fi redresata disfunctia plachetara in aceste conditii?